MYLPF突变导致一种表现为远端关节挛缩

　简介远端关节挛缩（DA）是一组孟德尔遗传病，涵盖了多种互相交叉的表型，它们的遗传学病因不同，但是有相似的发病机制。DAs的临床特征是四肢非进行性先天性挛缩，最常见于手、腕、足和踝关节。先天性面部、眼肌和颈蹼挛缩、翼状胬肉、身材矮小和脊柱侧凸的发生率较低，这些症状可以支持常见的DA病：DA1，DA2A和DA2B。有16个基因可以导致DA，最常见的是5个：TPM2,TNNI2,TNNT3,MYH3和MYH8。但是只有大约60%的DA家系可以找到致病变异，仍有近半病人不能找到遗传学病因。大多数DA基因编码骨骼肌纤维的肌节成分，因此编码肌节蛋白的基因被认为更有可能是DA的候选基因。肌节是肌肉的基本收缩结构，富含肌球蛋白的粗细丝与肌动蛋白的细丝相互作用产生收缩力。每一个骨骼肌的肌球蛋白重链（MyHC）都有两个不同的轻链蛋白结合在肌球蛋白的杠杆臂上：一个是接近肌球蛋白头部的基本轻链，另一个是可以磷酸化的调节性轻链，位于靠近肌球蛋白尾部的区域。为了寻找DA的新基因，作者对使用Sanger测序没有在已知DA1、DA2A、DA2B基因中找到致病变异的个家系进行了全外显子测序，在80个家系（47%）中找到了推定致病变异，其中44个家系的变异分别来自20个没有确认导致DA的基因。在2个病人（来自2个家系）中发现了同样的MYLPF基因（编码快速型骨骼肌调节轻链）纯合变异（c.GT）。其中一个病人有一只脚出现了骨骼肌完全缺失（i.e.节段性肌发育不良）。之后作者通过MatchMakerExchange(MME)以及直接同商业诊断性实验室合作寻找到了6个有相似症状且携带MYLPF基因罕见变异的家系，其中有两个家系症状是由亲代遗传给后代。既往研究显示mylpf敲除小鼠在出生时就没有骨骼肌并很快死于呼吸衰竭，提示人类的MYLPF变异可能是亚效等位基因。为了验证这个假设，作者运用CRISPR-Cas9技术沉默斑马鱼的mylpfa基因，分析mylpfa突变的骨骼肌发育和功能的特征。结果发现MYLPF变异FamilyA是一个近亲结婚家系，姐弟二人受累。两个患者均有手掌、手指、腕、肘、髋、膝、踝和颈部严重的关节挛缩，手肘和膝盖的翼状胬肉，小嘴巴和身材矮小。FamilyB也是近亲结婚家系，先证者携带同FamilyA一样的纯合变异。这个患者临床表现与FamilyA的患者相似，但是他还有严重的右足马蹄内翻，对治疗不耐受，最终导致小腿截肢。截下右足的病理结果显示骨骼肌完全缺失。这两个家系的病人都携带MYLPF基因c.GT（rs）纯合变异。之后作者通过MatchMakerExchange(MME)以及直接同商业诊断性实验室合作寻找到了6个有相似症状且携带MYLPF基因罕见变异的家系并描述了他们的基因型和表型。斑马鱼mylpf功能丧失导致肌肉无力和缺失Mylpf在脊椎动物间高度保守，提示它的功能也是保守的。既往研究显示mylpf敲除小鼠在出生时就没有骨骼肌并很快死于呼吸衰竭，但是没有证明肌肉是不能发育还是在正常发育之后出现退行性变。为了验证这一点，作者做了斑马鱼mylpfa敲除模型。斑马鱼mylpf有两个同源基因，mylpfa和mylpfb。这两个基因均在胚胎期和幼鱼的快肌纤维表达，其中mylpfa是主要表达基因（图1A-E）。mylpfa突变型的胸鳍完全瘫痪，并且逃避反应受损（图1I-J）。为了测试躯干肌的收缩性，作者给3df的完整胚胎电刺激，使用传感器记录肌力。在测试的所有频率下，mylpfaoz30的纯合变异胚胎都比对照组显著下降（图1K）。为了观察肌球蛋白及其组成的轻链的运动生成能力，作者从mylpfa突变型和同胞野生型斑马鱼中提取了单体肌球蛋白，并将其置于显微镜流动细胞室表面，之后加入荧光标记的丝状肌动蛋白，对提取的肌球蛋白产生的肌动蛋白运动进行成像。结果显示mylpfaoz30和mylpfaoz43的肌动蛋白丝速度都比野生型慢（图1L-M）。这些结果显示mylpfa突变的斑马鱼和DA病人一样出现了运动障碍，在肢体更明显。这种肌无力至少有一部分可以用快肌纤维肌球蛋白力量和运动受损解释。图1之后作者记录了斑马鱼肌肉随时间发生的变化，以验证肌肉是不能发育还是在正常发育之后出现退行性变。这对于解释携带p.CysPhe变异的患者足部出现的骨骼肌缺失尤为重要。在体节形成后不久，mylpfa突变斑马鱼的肌肉形态看起来是正常的（图2A-B）。但是，孵化后第6天（6dpf）的mylpfa突变斑马鱼在肌节的背腹高度上显著低于对照，并且肌纤维形状紊乱，提示快肌纤维随着时间退化（图2C-D），同一条鱼的慢肌纤维尚未受累（图2E-F）。肌肉缺陷在一个特定的肢体肌，后纵轴肌（PHM）中最为明显（图2G-J）。尽管PHM在mylpfa突变体的正常时间成型，最初便由多核肌构成，随着时间推移仍旧出现肌纤维碎裂变成如同4dpf的单核细胞“岛”（图2I-J）。PHM的肌肉退化要明显快于中轴肌，因为轴肌纤维先于肢体肌纤维形成，但在6dpf时仍然相对完整和多核（图2D和J）。为了验证mylpfa突变体的PHM细胞岛是退化的纤维还是新形成的单核成肌细胞，作者从84hpf开始使用共焦延时显微成像。在开始时大多数PHM纤维是完整的，有偶尔会缩小到接近闭合的波浪状的膜。膜紊乱随时间推移而明显，最后被断开。在每个时段还有新的PHM纤维增加（图2L-M）。这提示在成像期间仍旧有增生性生长。这些发现表明斑马鱼mylpfa是维持肌纤维完整性的必需条件，但在初始的肌纤维形成或增生性生长中不是必须的。作者据此提出假设，患者的节段性肌发育不良是肌肉正常形成又发生退化的结果。

图2

MYLPF的蛋白建模为了更好的理解MYLPF的显性遗传变异p.Ala33Val、p.GlySer和隐性遗传变异p.CysPhe、p.CysArg如何不同地起作用，作者使用了以往建立的兔Mylpf-Myl1-Myosin重链-肌蛋白复合体（PBD：5H53）（图3A-B）。兔Mylpf的对应位置和人类相比移位了1个氨基酸残基。Ala33在所有检测的真核生物中都保守，Gly在物种间高度保守，但是Cys只在脊椎动物中保守（图3C）。蛋白建模显示Ala33位于肌球蛋白重链附近，MylpfGly直接与肌球蛋白重链钩区附近的苯丙氨酸接触。与之相反，MylpfCys深埋在调节轻链中，与肌球蛋白重链没有接触（图3A）。图3讨论作者在8个没有血缘关系的家系中发现了4个MYLPF致病变异，这些病人有相似的表型特征，提示MYLPF突变可能造成了一个既往没有识别出来的多种畸形综合征。这种情况的特征是多发性先天性挛缩，脊柱侧凸和矮小，在临床上和其他基因导致的DA1有区别。作者发现近端关节挛缩和矮小在MYLPF突变造成的DA1比其它基因导致的DA1更常见。有一个病人出现了足部骨骼肌缺失，在其他病人中没有报道，但是作者缺乏其他病人的数据。此研究的发现提示MYLPF突变造成的DA1可以以显性和隐性模式遗传。斑马鱼实验显示缺乏mylpfa的肌球蛋白比野生型肌球蛋白移动丝状肌动蛋白的速度慢，且mylpfa突变肌纤维最终在所有肌肉中退化，PHM最严重。原文链接：Chongetal.,MutationsinMYLPFCauseaNovelSegmentalAmyoplasiathatManifestsasDistalArthrogryposis,TheAmericanJournalofHumanGenetics(),

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